Статьи

Оборудование для цитологии от Hettich

Оборудование для цитологии от Hettich
В современной клинической лабораторной практике центрифуги разного типа являются необходимым оборудованием для проведения цитологических исследований. Они используются как для традиционного способа концентрирования цитологических проб в стандартных сосудах и пробирках, так и для специальной обработки проб (градиентное и фильтрационное центрифугирование). В основе метода цитоцентрифугирования лежит центрифугирование жидкой среды с клеточным материалом с целью осаждения клеточных элементов из суспензии на слайд в специальной цитокамере во время центрифугирования. Входе цитоцентрифугирования получают тонкослойные высококачественные препараты для микроскопии и других видов цитологических исследований.


Цитоцентрифугирование является гибкой технологией, адаптируемой к конкретным методам цитологического исследования на основе фиксированных в объеме и нефиксированных клеточных суспензий.В процессе сепарации клетки распределяются ровным моно-слоем в строго определенной области предметного стекла. Благодаря этому существенно повышается диагностическая ценность цитологического исследования.
Подготовка монослойных цитопрепаратов осуществляется в центрифуге, оснащаемой ротором специальной конструкции. Цитоцентрифуги оснащаются специальными роторами с устройствами фиксации слайда, одноразовыми фильтрами, а также автоклавируемыми концентраторами клеток.
Основой системы цитоцентрифугирования является цитокамера – специальная пластиковая конструкция сложной формы, имеющая один или несколько каналов для внесения жидкой пробы с одной стороны и круглое или прямоугольное отверстие с резиновым уплотнителем – с другой При
сборке системы это отверстие герметично соединяется со слайдом. В процессе центрифугирования клетки осаждаются на открытую поверхность слайда. Могут быть использованы разные типы слайдов в зависимости от диагностической задачи. После удаления жидкости из цитокамеры систему разбирают и получают слайд-препарат с четко выраженной рабочей зоной и тонким слоем равномерно нанесенных клеток.

Цитосистема на основе цитокамеры с прямыми перпендикулярными каналами:
a) цитосистема в сборе; б) варианты цитокамер с прямым каналом; в) фильтр-вставки
для различных вариантов цитокамер

В случае применения многоканальных цитокамер, на одном слайд-препарате возможно получить несколько рабочих зон для цитологического исследования. При цитоцентрифугировании можно получать как влажные, так и сухие слайд-препараты – при помощи специальных вставок-фильтров, располагающихся между слайдом и цитокамерой.


Несмотря на наличие данных приспособлений, подготовка цито-препаратов требует проведения предварительных манипуляций: определения концентрации клеток в исследуемом образце и ее коррекции до оптимальных значений: 500 – 1500 клеток/мкл. При более высокой концентрации требуется предварительное разведение пробы, при более низкой образец необходимо предварительно сконцентрировать. Центрифугирование пробы с избыточной концентрацией клеточного материала не позволяет получить качественный препарат: клетки на слайде могут оказаться слишком близко или вообще перекрывать друг от друга (нарушается монослойность). При обработке проб с заранее определенной низкой концентрацией клеточного материала качество препаратов может быть приемлемым, но исследовать их сложно.
В зависимости от модели ротора можно обрабатывать от 4-х до 12 образцов объемом от 0,05 до 0,8 мл.

Среди этапов технологии цитоцентрифугирования можно выделить:
1. Получение пробы.
2. Перемешивание пробы.
3. Проведение дополнительных операций по улучшению качества цитологического препарата непосредственно в цитокамере (отмывка и осветление клеточных суспензий, лизис эритроцитов, разделительное центрифугирование в градиентном растворе, коррекция концентрации клеток).
4. Дозирование пробы в герметичную систему из цитокамеры и слайда.
5. Горизонтальное центрифугирование с осаждением клеточных элементов на слайд и получением препаратов для фиксации и окраски (возможна фиксация и окраска слайдов непосредственно в цитокамере).
 6. Высушивание препарата в специальной подвеске центрифуги за счет эффективной системы вентиляции, возникающей при вращении ротора.
7. Автоматический или ручной анализ.


Исследование спинномозговой жидкости (СМЖ)


Исследование спинномозговой жидкости (СМЖ) является одним из существенных этапов диагностики бактериальных или грибковых менингитов и должно рассматриваться в качестве приоритетного анализа, на который лабораторный персонал должен обращать повышенное внимание. В норме СМЖ стерильна и прозрачна, в 1,0 мл содержится три или менее лейкоцитов, эритроциты отсутствуют. При менингеальных или церебральных воспалениях, таких, как менингиты или энцефалиты, химический и цитологический состав СМЖ подвергается изменениям.
В две пробирки врач, применяя люмбальную или межпозвонковую пункцию, стерильно отбирает СМЖ в количестве 5—10 мл. Отобранные образцы сразу же следует доставлять в лабораторию, где к их исследованию приступают немедленно, поскольку форменные элементы подвергаются быстрой дезинтеграции. Любая задержка может привести к уменьшению числа содержащихся в СМЖ клеток, что в свою очередь не позволит получить точного представления о реальной клинической картине.
При макроскопическом исследовании полученную пробу СМЖ оценивают визуально, используя следующие определения: чистая, слегка мутная, мутная, гнойная, желтая или ксантохромная (в результате гемолиза или желтухи), кровянистая, с паутинкой фибрина или пленкой.
При микроскопическом исследовании необходимо приготовление цитологических препаратов.
Если предстоит исследование очень мутной пробы СМЖ, к ее анализу приступают немедленно, без предварительного центрифугирования. Во всех других случаях пробы СМЖ подвергают центрифугированию в стерильных пробирках (предпочтительно в конических пробирках с завинчивающимися крышками емкостью 15,0 мл) в течение 5—10 мин. Надосадочную жидкость  отбирают стерильными пастеровскими пипетками (пипетирование осуществляют с помощью резиновой груши) и переносят в другую пробирку для химических и (или) серологических исследований, осадок используют для микробиологических исследований.
При прямом микрокопировании под микроскопом (объектив х400) исследуют осадок, поместив каплю на предметное стекло и накрыв сверху покровным стеклом. С помощью этого метода выявляют:
• лейкоциты (полиморфизм нейтрофилов или лимфоцитов);
• эритроциты;
• бактерии;
• дрожжи.
Поскольку этиологические агенты бактериальных менингитов часто обнаруживаются в окрашенных по Граму мазках, такое исследование весьма важно. Высушенный на воздухе мазок осторожно фиксируют на пламени горелки и окрашивают по Граму. Микроскопическое исследование проводят при увеличении х1О0О (обязательно с использованием иммерсионно-масляного объектива) в течение по крайней мере 10 мин или пока бактерия не будет обнаружена.

Преимущества метода Hettich
Часто возникает необходимость во внедрении удобной процедуры цитоцентрифугирования, с сохранением целостности клеток и получения приемлемого, надежного и воспроизводимого результата. Однако в лаборатории наблюдается нехватка времени, длительное ожидание  или необходимость круглосуточной доступности цитодиагностики, заметный рост числа диагностических параметров при том же или меньшем количестве ткани, доступной для анализа. То приведенный ниже метод отвечает этим требованиям.  Он обеспечивает подготовку клеточных суспензий на предметных стеклах за один шаг с использованием угловых камер в центрифуги Hettich.


1. Подготовка

A) Спинномозговая (Цереброспинальная) жидкость
Цель методики состоит в том, чтобы по крайней мере 200 клеток можно было обнаружить на стекле в зоне седиментации и обеспечить адекватную процентную дифференциацию. Количество клеток сначала устанавливается до центрифугирования с помощью счетной камеры.  Используемый объем должен быть предпочтительнее 800 мкл и не должен быть меньше 200 мкл, так как это приведет к снижению однородность до нежелательного уровня.
1. Подготовка образцов
Белок необходимо добавлять в суспензии с содержанием менее 10 клеток / мкл и концентрации белка ниже 3000 мг/литр (так обстоит дело с большинством образцов СМЖ) для буферизации и стабилизации клеток. Верхнего предела для концентрации белка практически не существует: 50 мкл нормальной сыворотки (альбумин) добавляется к объему образца 400 мкл для получения концентрации белка выше 3000 мг/литр для СМЖ, которая не содержит крови и является неразбавленной. Если необходимо разбавить СМЖ, то ее можно разбавить физиологическим раствором NaCl в соотношении 9:1. Раствор NaCl должен быть приготовлен свежим в день использования, храниться в холодильнике и довести до комнатной температуры перед использованием. Если имеется достаточное количество гомологичной СМЖ, то ее можно разбавить бесклеточным супернатантом, полученным путем центрифугирования. Параметры центрифугирования такие же, как и при получении сыворотки из крови.
1.1. СМЖ без крови:
Ниже приведены приблизительные разведения для образца объемом 400 мкл при следующем количестве клеток:
Из этого количества только 200 мкл должно быть добавлено в угловую камеру Hettich.


1.2. СМЖ, содержащая кровь:
Разведения, приведенные выше, применимы для СМЖ, содержащей кровь в ограниченном количестве, поскольку она также будет содержит эритроциты в дополнение к белым клеткам. При выборе параметров разведения и объема разбавленной клеточной суспензии необходимо не только предотвратить включение слишком большого количества эритроцитов, но и избежать разбавления эритрофагов и гемосидерофагов, которые необходимы для диагностики.


2. Выбор подходящих принадлежностей

Для суспензии клеток объемом 400 - 800 мкл рекомендуется:
-  угловая камера № 1672 Она имеет площадь осаждения площадью 60 мм² и диаметром 8,7 мм.
- соответствующая фильтровальная карточка № 1697.
- предметное стекло покрытием Polysine для обычного окрашивания по Паппенгейму
- предметные стекла с покрытием Super Frost® для иммуноцитологического демонстрации маркеров клеточной поверхности, особенно опухолевых маркеров.

3. Сборка цито-вставки

Предметное стекло, цитокамера и фильтровальная карта закрепляются на держателе слайдов (кат. № 1662) с помощью крепежного кольца. Поверните кольцо до упора и сохраняя натяжение, поверните его обратно на небольшую величину,  чтобы после центрифугирования весь  супернатант был впитан фильтровальной картой и не оставалось остатков жидкости на поверхности осадка.


4. Центрифугирование

a) Заполнение образца
Чтобы заполнить образец, поместите цито-вставку вертикально на или поместите его в цитосуспензию (кат. № 1680) и пипеткой наберите подготовленный образец в воронку камеры.
б) Седиментация
Можно использовать одну из двух программ центрифугирования:
Программа 1: 3 минуты при 100 x g (для обычного применения).
Программа 2: 4 минуты при 50 x g
c) Разборка цито-вставки
Перед разборкой цито-вставки убедитесь, что вся жидкость впиталась. Если это так, то извлеките цито-вставку из центрифуги, ослабьте крепежное кольцо, снимите камеру и выньте предметное стекло микроскопа вместе с фильтр-картой. Осторожно извлеките фильтр-карту, не нарушая осадок. Дайте осадку высохнуть на воздухе.



Важно: Если клетки сушить слишком долго, они могут быть повреждены!

Если после центрифугирования в угловой камере все еще остается жидкость, то ее необходимо удалить, сохраняя при этом угловую камеру в вертикальном положении. Затем ослабьте крепежное кольцо, удерживая угловую камеру в вертикальном положении так, чтобы жидкость, все еще находящаяся на поверхности осадка медленно и равномерно распределяется по фильтровальной карте при этом однородность осадка не нарушается.
г) Окрашивание препаратов по Паппенгейму
Нефиксированные мазки заливают неразведённой готовой краской Май-Грюнвальда (это смесь эозина и метиленовой сини, которая не содержит следов азура, но готовится на метиловом спирте; вследствие этого приобретает свойства фиксатора) на 3минуты. Наливают небольшое количество воды. Через 1 минуту, не споласкивая, заливают рабочим раствором красителя Романовского-Гимза на 10-12 минут. По окончании окраски споласкивают в забуференной воде. Специальное окрашивание и выявление иммуноцитологических маркеров поверхности клеток (таких как лимфоциты и опухолевые маркеры) также могут быть проведены с высушенными и нефиксированными осадками клеток в соответствии с соответствующими операционными процедурами

5. Разведение других проб

Диализаты обычно не нуждаются в разбавлении (50 мкл сыворотки добавляется на 400 мкл объема образца). При плевральных выпотах и асците количество клеток обычно колеблется между 50 и 5 000 клеток/мкл, поэтому если в качестве объема образца используется 400 мкл. Условия разведения, приведенные для СМЖ, не содержащей крови, можно могут быть приняты. Поскольку содержание белка как в плевральных выпотах, так и в асцитической жидкости асцита очень высоко - от 20 до 40 г/литр - образцы можно разбавлять 1:10 физиологическим солевым раствором без добавления белка.



Исследование мочи


Моча является объектом, наиболее часто предлагаемым для исследования на наличие микроорганизмов. Большая часть инфекций мочевого тракта локализована в мочевом пузыре и уретре. Из этих органов инфекция может подниматься по уретре (уретрит) и впоследствии поражать почки (пиелонефрит). Этиологическими агентами большинства инфекций мочевого тракта являются банальные кишечные бактерии. Приблизительно у 10 % пациентов, страдающих заболеваниями мочевого тракта, в моче могут присутствовать два микроорганизма, оба из которых могут рассматриваться как возбудители заболевания. Наличие в моче трех или более различных микроорганизмов является серьезным основанием для предположения об ошибках при взятии проб мочи или последующих манипуляциях. Предпочтительно отбирать утренние порции мочи.
В связи с тем, что моча сама по себе является хорошей питательной средой, все пробы следует доставлять в лабораторию в течение 2 ч после отбора или хранить в холодильнике при 4 С до момента доставки в лабораторию и начала исследования, однако срок не должен превышать 18 ч.
Приготовление и микроскопия окрашенного по Граму мазка является необходимым составным элементом лабораторного исследования. Используя стерильную пастеровскую пипетку (отдельно для каждой пробы), наносят каплю хорошо перемешанной нецентрифугированной мочи на предметное стекло. Дают капле высохнуть на воздухе без использования пламени горелки, затем окрашивают. Проводят микроскопическое исследование с использованием масляно-иммерсионного объектива для определения наличия или отсутствия микроорганизмов, полиморфно-ядерных лейкоцитов и слущенных эпителиальных клеток.
Одна или более бактериальных клеток в одном поле зрения микроскопа всегда свидетельствует о наличии 10 или более микроорганизмов в 1,0 мл исследуемого образца. Наличие одного или более лейкоцитов в одном поле зрения микроскопа является характерным индикатором инфекции мочевого тракта. В моче здорового человека во всем мазке обнаруживается лишь несколько бактериальных клеток или лейкоцитов,  либо не обнаруживается совсем. В мазках из мочи, взятой у женщин, наличие большого числа слущенного эпителия независимо от того, обнаружены или не обнаружены любые бактериальные клетки, является очень серьезным предположением о бактериальной контаминации мочи влагалищной микрофлорой, в связи чем необходимо взять на исследование повторную пробу мочи независимо от числа бактерий в одном поле зрения микроскопа. Если ответ требуется срочно, можно направить лечащему врачу сообщение о результатах, полученных при исследовании мазка, окрашенного по Граму, с указанием, что в дальнейшем будут представлены результаты о полученных культурах. Отсутствие лейкоцитов и микроорганизмов в мазке, окрашенном по Граму и исследованном, как описано выше, является хорошим свидетельством того, что моча не инфицирована. Пробы мочи, которые дали отрицательные результаты при внимательном микроскопическом исследовании полученного из них и окрашенного по Граму мазка, не нуждаются в дальнейшем культивировании.

Методика работы со стеклами для цитологии мочи


Для получения хорошего цитологического препарата из образца мочи недостаточно просто центрифугировать нативную мочу на предметные стекла микроскопа. В моче низкая концентрация клеток, а те клетки, которые в ней присутствуют плохо прилипают к предметным стеклам. Это в результате получится препарат с недостаточной концентрацией клеток концентрация.
Чтобы увеличить концентрацию клеток  необходимо покрыть предметное стекло (раствор Поли-L-лизин, Sigma, кат. № P8920) или использовать подходящий фиксатор (раствор Саккомано).

Преимущества метода Hettich
1. Высокий выход клеток
- Благодаря покрытию предметного стекла микроскопа
- Благодаря помещению клеток в фиксирующую жидкость, что улучшает адгезию клеток
2. Хорошее качество препарата
- Использование раствора Саккомано позволяет получить осадки  с очень чистым фоном.
- Клетки уротелия образуют монослой
- Покрытие PLL делает видимыми не только клетки, но и другие мелкие частицы, такие как бактерии.

1. Подготовка

1. Подготовка предметного стекла
Для нанесения покрытия на предметные стекла можно использовать два метода: с PLL - метод погружения (раствор Поли-L-лизин, Sigma, кат. № P8920)  и покрытие в центрифуге. Метод погружения прост и удобен использовать, но покрытие иногда получается неравномерным.
Нанесение покрытия в центрифуге является более трудоемкой, но всегда дает очень хорошие результаты.
а) Метод погружения
- Разбавьте PLL 1:10 дистиллированной водой и залейте в кювету.
- Погрузите коммерческие предметные стекла в этот раствор без предварительной обработки и оставьте их в растворе на 5 минут. PLL должен быть комнатной температуры.
Извлеките предметные стекла и высушите их в горизонтальном положении в обогреваемом шкафу при температуре около 60 °C. Слайды готовы к использованию, как только слой PLL высохнет.
б) Нанесение покрытия в центрифуге
- Разбавьте PLL 1:10.
- Положите неочищенные предметные стекла на держатель для предметных стекол (кат. № 1662) и закрепите камеру объемом 8 мл (кат. № 1666).
- Залейте 100 мкл разбавленного PLL в цитокамеру.
- Центрифугируйте цито-вставку при 1100 x g в течение одного часа. (соответствует 3000 мин-1 для 6-местного ротора и 3 200 мин-1 для 4-местного ротора. Образец может быть помещен непосредственно в цитокамеру.

2. Подходящие принадлежности Hettich

Для центрифугирования мочи мы рекомендуем использовать нашу самую большую цитокамеру объемом 8 мл и площадью седиментации 240 мм². Во многих случаях это позволит избежать необходимости предварительного центрифугирования в пробирках.

3. Сборка цито-вставки

Для слайд-препаратов из мочи обычно необходимо использовать влажную фиксацию. Поэтому цито-вставка должна быть собрана без фильтрующей карты Если образцы являются инфекционными, то мы рекомендуем использовать нашу крышку № 1661


4. Центрифугирование

a) Осаждение
Центрифугируйте цитокамеры в течение 5 минут при 1100 x g (соответствует 3000 мин-1 при 6-местном ротора и 3200 мин-1 с 4-местным ротором.


б) Удаление бесклеточного супернатанта
Бесклеточный супернатант остается в камере после центрифугирования и удаляется путем осторожного декантированием или пипетированием. Важно, чтобы чтобы осадок не был потревожен во время удаления супернатанта, так как это может повлиять на качество процедуры и/или привести к потере клеток.
в) Фиксация и окрашивание
После удаления надосадочной жидкости влажный препарат может быть немедленно зафиксирован (например, в 99% этаноле), а затем окрасить.

Подготовка цитологического образца с использованием раствора Саккомано

1.   Подготовительные этапы
a) Подготовка образца мочи
- Центрифугируйте образец мочи в пробирке в течение 10 минут при 1700 x g (3600 мин-1 с 6-местным ротором и 4 000 мин-1 с 4-местным ротором).
- Декантируйте надосадочную жидкость.
Важно: осадок в центрифужной пробирке необходимо разрыхлить перед добавлением раствора Саккомано (лучше всего это сделать легким постукиванием основанием пробирки о твердую поверхность).
- Добавьте раствор Саккомано и дайте ему отстояться в течение 30 минут при комнатной температуре.
б) Приготовление раствора Саккомано
Чтобы приготовить 100 мл раствора Саккомано, смешайте 43 мл дистиллированной воды, 53 мл 95% этанола и 4 мл полиэтиленгликоля (ПЭГ).
в) Приготовление исходного раствора полиэтиленгликоля раствор:
- Нагрейте полиэтиленгликоль 1500 (Merck Darmstadt, Кат. № 807489) и дистиллированную воду до 60 °C.
- Одинаковые объемы каждого из них (например, 50 мл ПЭГ и 50 мл дистиллированной воды) нагревают и смешивают.
- Дайте исходному раствору остыть до комнатной температуры до начала приготовления раствора Саккомано.

Центрифугирование

a) Осаждение
Цитокамеры центрифугируются в течение 5 минут при 1100 x g (что соответствует 3000 мин-1 с
6-местным ротором и 3200 мин-1 с 4-местным ротором).
b) Удаление бесклеточного супернатанта
Бесклеточный супернатант остается в камере после центрифугирования и удаляется путем декантирования.
в) Фиксация и окрашивание
После удаления супернатанта извлеките цито камеру и дайте осадку высохнуть на воздухе до тех пор, пока не образуется пока не образуется воскоподобный осадок. Перед окрашиванием воскоподобный осадок должен быть удален путем погружения в 50% этанол примерно на 10 минут.


Методика подготовки  стекол с  бронхиальных смывов для цитологического исследования


Микроскопическое исследование
Пробу гнойной или гнойно-слизистой мокроты используют для приготовления мазка, который окрашивают по Граму.Если не наблюдаются включения гноя (например, в слизистой мокроте серого цвета) в мазке, окрашенном по Граму, то могут быть обнаружены лишь большие, прямоугольной формы, слущенные эпителиальные клетки, часто сплошь покрытые бактериальными клетками. Это свидетельствует о том, что мокрота содержит в основном секреты ротовой полости и глотки, культивирование такой пробы неуместно, поскольку результаты будут сомнительными. В соответствии с общепринятыми рекомендациями следует отказаться от культивирования образцов мокроты, которые содержат менее 10 полиморфно-ядерных нейтрофилов на одной эпителиальной клетке . Результаты срочного микроскопического исследования окрашенного по Граму мазка гнойной мокроты, полученной от больных острыми респираторными заболеваниями (например, пневмонией), во многих случаях могут послужить клиницистам руководством для выбора антимикробной терапии.
Промывание бронхов - это промывание дыхательных путей дыхательных путей физиологическим солевым раствором. Эта процедура используется для извлечения клеточного материала и/или любых инвазированных инородных тел для изучения под микроскопом.
Бронхиальные смывы здоровых некурящих людей состоят примерно на 90% из макрофагов и максимум 15% лимфоцитов, до 3% гранулоцитов и 0,5% эозинофилов. Промывание богато клетками и в большинстве случаев также содержит слизь. У пациентов с определенными заболеваниями обычно этот клеточный  состав изменяется и предоставляет ценную информацию для диагностики. Может быть обнаружено наличие вдыхаемых инородных тел, таких как асбестовые частицы и патогенные микроорганизмы (например, туберкулезные бактерии и pneumocystis carinii у пациентов со СПИДом) Поэтому цитологические препараты получают из бронхиальных смывов для диагностики большого числа легочных и респираторных заболеваний. Препараты обычно окрашиваются иммуноцитохимически или по методу окрашивания Паппенгейма.

Преимущества метода Хеттиха
1. Простота подготовки
2. Отличное качество препарата
- Равномерное распределение клеток в осадке
- Оптимальное распределение клеток
- Отсутствие избирательной потери клеток, представлены все типы клеток
- Оценка проста, так как клетки сконцентрированы на определенной площади


1. Подготовка пробы

Поскольку бронхиальные смывы часто содержат слизь, что может повлиять на качество подготовки, слизь должна быть удалена заранее. Поэтому промывание фильтруется через 2 слоя марли.

2. Подходящие аксессуары

Поскольку промывка богата клетками, то рекомендуется использовать камеры объемом 2 мл и 4 мл с площадью осадка 60 мм² или 120 мм².
Объем образца, заполняемого в камеры, зависит от содержания клеток. Каждый мм² площади осадка в камере должно содержаться от 1 000 до 2 000 клеток. Таким образом  в камеру площадью 60 мм² следует поместить  от 60 000 до 120 000 клеток, и от 120 000 до 240 000 клеток  в камеру площадью 120 мм². (Количество ячеек можно определить с помощью счетчика Фукса-Розенталя).

3. Сборка цито-вставки

Препараты, полученные из промывания бронхов. центрифугируются, а затем высушиваются на воздухе. По этой причине вставка должна быть собрана без фильтровальной карты. Когда работаем с  инфекционными образцами,то  вставки должны быть должны быть закрыты крышкой № 1661 для предотвращения выхода аэрозолей.

4. Центрифугирование

a) Осаждение
Центрифугируйте цитокамеры в течение 20 минут при 275 x g (это соответствует 1 500 мин-1 с
6-местным ротором и 1 700 мин-1 4-местным ротором).
б) Удаление бесклеточного супернатанта
После центрифугирования свободный от клеток супернатант все еще находится в камере и должен быть удален как можно более полностью.
в) Высушивание осадка
Существуют различные подходы к высушиванию осадка:
1. После пипетирования надосадочной жидкости снимите цитокамеру и дайте осадку высохнуть на воздухе.
2. Метод д-ра Баркхофена
После центрифугирования выньте цито-вставку из центрифуги и наклоните ее на одну сторону, чтобы дать возможность жидкости вытечь. Оставьте цито-вставку в таком положении на по крайней мере на 1 час для высыхания или на более длительное время, если это возможно (например, на ночь). Затем удалите цитокамеру и дайте возможность оставшемуся кольцу остатков жидкости высохнуть на воздухе.
d) Фиксация и окрашиваниеТеперь высохший препарат можно закрепить и окрасить. 1 700 мин-1 в 4-местном роторе).



Слайд-препараты для цитологии плевральной жидкости и асцитической жидкости


Помимо мезотелиальных клеток, плевральная и асцитическая жидкость также содержат лимфоциты, эозинофильные и нейро- трофические гранулоциты. Содержание белка часто составляет около 30 г/л. Содержание клеток часто значительно варьируется. Обе жидкости могут содержать кровь, а асцитическая жидкость может также содержать липиды.

Преимущества метода Hettich
1. Цитокамеры для различного содержания клеток и объёмов
2. Высокий выход клеток
3. Хорошее качество клеток
4. Оптимальное распределение клеток


1. Подготовка образцов с высоким содержанием эритроцитов

Поскольку высокое содержание эритроцитов будет иметь негативное негативно влияет на качество препарата, рекомендуется рекомендуется удалить эритроциты с помощью лизиса буфера перед получением цитопрепарата.
a) Приготовление буфера для лизиса
8,29 г хлорида аммония (NH4Cl)/1,0 г гидрокарбоната калия (KHCO3)/0,037 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до 1 литра дистиллированной воды.
Буфер для лизиса следует автоклавировать, чтобы продлить его срок годности.
б) Лизис эритроцитов
- Центрифугируйте жидкость для образца в течение 10 минут при 350 x g (что соответствует 1 700 мин-1 в 6-местном роторе и 1 900 мин-1 в 4-местном роторе).
- Пипеткой отберите супернатант и отложите его в сторону.
- Ресуспендируйте осадок в буфере для лизиса (1 часть по объема осадка к 10 частям по объему буфера).
- Хорошо перемешайте и дайте постоять 10 минут при комнатной температуре. температуре. Освобожденный гемоглобин приобретает прозрачное красное окрашивание.
- Остановите реакцию, добавив 10 x объем физиологического солевого раствора (0,9% NaCl) или фосфатно-буферного физраствора.
- Центрифугируйте при 350 x g в течение 10 минут.
- Декантируйте супернатант, содержащий лизированные эритроциты и выбросьте его.
- Ресуспендируйте осадок в 10 мл 0,9% NaCl (или PBS), тщательно перемешайте и снова центрифугируйте в течение 10 минут при 350 x g.
- Отбросьте супернатант и повторно взвесьте осадок в супернатанте исходного образца, который был отложен в сторону, и хорошо перемешайте. Теперь можно получить цитопрепарат из образца.
Важно: Не позволяйте клеткам стоять в буфере для лизиса не позволяйте клеткам стоять в буфере для лизиса слишком долго, так как это может привести к их лизису.

2. Выбор подходящих принадлежностей

Камера объемом 2 мл (кат. № 1664) с площадью осаждения 60 мм2 и камера объемом 4 мл (кат. № 1664). площадью осаждения 60 мм2 и камера объемом 4 мл(кат. № 1665) с площадью седиментации 120 мм2 рекомендуются для центрифугирования плевральной жидкости и асцитической жидкости. Камера объемом 2 мл подходит для образцов, содержащих до 100 000 клеток, и 4 мл для образцов, содержащих до 100 000 клеток, а 4 мл - для образцов, содержащих до 200 000 клеток.

3. Сборка цито-вставки

Для приготовления слайдов из плевральной жидкости и асцитической жидкости как правило, необходимо использовать сухую фиксацию. Цито вставка должна быть собрана вместе с фильтрующей. Если образцы инфекционные, то мы рекомендуем использовать нашу крышку № 1661 /

4. Центрифугирование

a) Осаждение
Залейте образцы в пробирки для центрифугирования и центрифугируйте их в течение 10 минут при 490 x g (что соответствует 2 000 мин-1 при 6-местном роторе и 2 200 мин-1 при 4-местным ротором).
б) Удаление бесклеточного супернатанта
Бесклеточный супернатант остается в камере после центрифугирования и должен быть удален путем осторожной аспирацией.
Важно, чтобы осадок не был потревожен во время во время удаления супернатанта, так как это может повлиять на качество препарата и/или привести к потере клеток.
Поэтому рекомендуется, чтобы надосадочная жидкость была удалена  с помощью пипетки Пастера с кончиком чуть ниже поверхности супернатанта, двигаясь вниз. Пипетка не должна соприкасаться с предметным стеклом- следует оставить небольшую каплю жидкости. Небольшая капля жидкости должна остаться над осадком!
в) Высушивание осадка
Осадок должен быть высушен, если клетки будут окрашивание с использованием красителя Гимзы. Это требует второго центрифугирования. После удаления надосадочной жидкости ослабьте предметное кольцо и удалите его вместе с камерой. Поместите держатель слайдов с предметным стеклом и фильтровальной картой вместе с суспензией обратно в центрифугу и центрифугируйте их в течение 1 минуты при 1 100 x g (что соответствует 3 000 мин-1 с 6-местным ротором и 3 400 мин-1 с 4-местным ротором).
Оставшаяся жидкость будет удалена с помощью центрифужной  силы и поглощена фильтровальной картой. Клетки останутся в виде осадка на предметном стекле. Их морфология будет нетронутой, и они будут хорошо распределены по поверхности. Артефакты испарения, к уменьшенные в объеме лейкоциты  и кристаллы  будут исключены благодаря сухому центрифугированию.
г) Фиксация и окрашивание
Сухой препарат может быть немедленно зафиксирован, а затем необходимо провести окрашивание.
Если используется окраска по Гимзе или Май-Грюнвальду-Гимзе, то предметные стекла должны быть промыты в буфере Вайзе или на последнем этапе необходимо промыть предметные стекла буфером Вайзе или Сёренсена. Затем они должны быть высушены.
- Поместите предметные стекла, промытые в буфере Вейзе, в рамку и вставьте рамку в центрифугу.
- Центрифугируйте в течение 1 минуты при 275 x g (что соответствует 1 500 мин-1 в 6-местном роторе и 1 700 мин-1 в 4-местном роторе).
- Извлеките рамку с сухими предметными стеклами из центрифуги.
- Теперь препараты готовы для микроскопии и/или или монтажа на покровное стекло.
- Вытрите суспензию насухо.
Одновременно можно высушить до 36 предметных стекол в 6-местном роторе.